Amplification isotherme

Les méthodes d’amplification isotherme peuvent être utilisées en laboratoires ou déclinées sous forme de kits de détection utilisables directement sur la parcelle.

Principe : 

Il s’agit d’un ensemble de méthodes qui sont parfois qualifiées de PCR isothermes. Ces méthodes partagent avec la PCR l’amplification spécifique d’un ou plusieurs marqueurs moléculaires (ADN/ARN) par une ADN/ARN polymérase. Elles sont qualifiées d’isotherme puisqu’elles se font à une température constante. Les méthodes les plus utilisées en diagnostic végétal sont les méthodes LAMP et RPA.

• La méthode LAMP

La méthode LAMP (Loop-Mediated Amplification), présente des niveaux d’amplification qui approchent ceux de la PCR classique. Elle présente un très haut niveau de spécificité, lié à l’utilisation de 6 amorces. Cette méthode d’amplification est en générale très rapide. Elle se fait à une température comprise entre 60-65°C et ne comporte pas d’étape de purification et de dénaturation de la séquence nucléique cible.

Les étapes sont :

1. Hybridation avec 3 amorces sens suivie d’une élongation

2. Hybridation du nouveau brin avec 3 amorces anti-sens suivie d’une élongation

3. Révélation. Cette méthode génère des sous-produits qui forment un précipité blanc et augmentent la turbidité de la solution. La détection de l’amplification peut donc être réalisée par un grand nombre de méthodes telles que l’électrophorèse, la détermination turbidimétrique, des méthodes électrochimiques ou simplement colorimétriques (par exemple via l’utilisation de SybrGreen).

Comme pour la PCR, il existe plusieurs déclinaisons de cette méthode : la LAMP classique, la LAMP en temps réel, la RT-LAMP ou encore la RT-LAMP en temps réel.

• La méthode RPA

La méthode RPA (Recombinase Polymerase Amplification) est une méthode d’amplification isotherme réalisée à basse température (37-39°C). Cette méthode s’appuie sur l’utilisation de complexes formés par des amorces oligonucléotidiques et une recombinase permettant de faciliter l’hybridation des amorces. Comme pour la méthode LAMP, il n'y a pas d'étape de purification et de dénaturation de la séquence nucléique cible.

Les étapes sont :

1. Formation d’un complexe entre les amorces oligonucléotidiques et des recombinases

2. La recombinase va permettre l’hybridation des amorces avec l’acide nucléique 

3. Elongation

4. Révélation. Il existe un grand nombre de méthodes permettant la révélation des produits d’amplification. Le plus souvent elles sont basées sur la fluorescence, par l’utilisation de sondes ou d’agents intercalant.

Cette méthode est utilisée pour les kits de terrain. 

• Kit de terrain

Les échantillons sont broyés dans un sachet spécial contenant un tampon d’extraction. Une partie du jus d’extraction est récupéré et placé dans un tube contenant les réactifs (préalablement réhydraté), ce tube va ensuite être placé dans un bloc chauffant portatif. Ce bloc va permettre de maintenir le milieu réactionnel à une température donné pendant 20-30 minutes. Le tube est ensuite placé dans une chambre de réaction qui va permettre de révéler les résultats, lesquels pourront être lu sur une bandelette.

Les informations présentées sont issues des fiches rédigées par des élèves ingénieurs de la spécialisation protection des cultures de l'ENSAIA dans le cadre des actions de l'axe 2 du RMT VEGDIAG.