Observation au microscope électronique

Principe : 

Les microscopes électroniques utilisent un faisceau de particules d'électrons pour illuminer un échantillon et en créer une image très agrandie. Ces microscopes ont une plus grande résolution que les microscopes optiques. Ils permettent d'observer des éléments de quelques nanomètres. Il existe différents types de microscopes électroniques :

• Microscope électronique en transmission (MET)
• Microscope électronique à balayage (MEB)
• Microscope électronique à balayage en transmission (MEBT)

Pour identifier un virus, c'est le microscope électronique en transmission qui est utilisé. Il permet dans les étapes de diagnostic de 1) vérifier si les symptômes sont dus à des virus, et si des virus sont présents, 2) d'identifier la forme des virus présents. Connaitre la forme peut permettre, dans le meilleur des cas, d'identifier le genre auquel appartient le virus. Dans les autres cas, l’identification s’arrête au niveau de la famille ou de la méta-famille.

Cette observation doit être suivie d'analyses PCR pour déterminer précisément le virus. La connaissance de la méta-famille, de la famille ou du genre permet de réduire le nombre de PCR (amorces spécifiques à la famille ou au genre).

Préparation des échantillons

• Prélever 1 à 2 jeunes  feuilles avec symptômes fraiches (maximum 4-5 jours à 5°C) ou à défaut congelées de préférence à -80°C de petite taille. Eviter de prélever les nécroses (tissus morts).
• Broyer 1 à 2 morceaux de feuille (environ 1 à 2 cm²) dans une solution tampon (0,5 mL de Phosphate Sorensën) afin d'obtenir un jus homogène.
• Déposer une grosse goutte sur un morceau de Parafilm®. Si le virus est fragile, prévoir de réaliser cette étape sur de la glace pilée.
• Déposer une grille, spécifique pour les observations au MET, sur la goutte et laisser absorber.
• Récupérer la grille et l'égoutter avec du papier adapté et propre.
• Verser quelques gouttes de Molybdate d'ammonium à 1% sur la grille puis
• Egoutter et laisser sécher la grille.
• Stocker la grille à température ambiante dans la boite de transport et l'observer dans un délai de 3-4 jours maximum.