La préparation microscopique

L'identification des petits diptères (adultes, larves, nymphes) nécessite une préparation préalable pour l'observation des caractères de taille microscopique (figure 1).

figure 1	figure 2	figure 3	figure 4

Montage permanent dans une résine :
Un montage permanent permet une conservation de longue durée nécessaire à la constitution d'une collection de référence.

La préparation du spécimen consiste à (figure 2) :
1/ éclaircir dans une base forte (KOH ou NaOH)
2/ rincer
3/ déshydrater dans un gradient d'alcool (70°, 95°)
4/ dégraisser (essence végétale)
5/ monter dans un milieu d'inclusion permanent (Baume du Canada ou Euparal)


Préparations particulières de spécimens (figure 3) :
- la coloration des larves

• coloration des larves à la fuschine acide (fuschine + lactophénol d'Aman) est parfois nécessaire en microscopie photonique classique pour une meilleure observation des formations tégumentaires (pores, papilles, épines) indispensables à l'identification de certaines espèces ;
• pas de déshydratation après coloration mais éventuellement un dégraissage dans un bain d'essence de lavande si les larves présentent des inclusions lipidiques sinon montage direct ;
• la coloration n'est pas nécessaire avec un microscope à contraste de phase ou interférentiel.

- l'éclaircissage enzymatique

• la technique est adaptée d'un protocole d'extraction d'ADN en vue d'un éclaircissage de spécimens adultes basée sur l'action « digestive » de la protéinase K dans une solution tampon chauffée à 50-55°C au bain marie pendant 1h30 à 3h (selon la taille des spécimens) ;
• les avantages : il n'y a pas besoin d'extraire les ailes, la digestion est douce et les spécimens sont parfaitement éclaircis ;
• les inconvénients: selon les espèces, on observe parfois un léger « gaufrage » des ailes;  la lyse n'a que peu ou pas d'action sur les réserves lipidiques contenues dans la cavité centrale des larves, ce qui est souvent le cas. Ces réserves de corps gras seront éliminées plus tard dans un bain d'essence ou d'huile essentielle de lavande.

Montage temporaire (figure 4) : 

• pour un diagnostic immédiat, la préparation est simplifiée mais la conservation de l'échantillon est de courte durée, quelques jours à plusieurs semaines ;
• la préparation du spécimen consiste à:

1/ éclaircir dans une base forte (KOH ou NaOH) ou un acide (acide lactique à chaud ou à froid)
2/ rincer
3/ monter dans un milieu temporaire (lactophénol, glycérine ou acide lactique)


Conseils:

• l'emploi de certains réactifs est dangereux pour la santé: Eurapal et lactophénol doivent être manipulés sous hotte chimique dotée de filtres adéquats.
• les préparations permanentes dans le Baume du Canada nécessitent au moins 15 jours de séchage à température ambiante avant rangement dans des boîtes à lames ;
• l'acide lactique a un pouvoir éclaircissant (chaud ou froid),  le spécimen ou la pièce à observer (aile par exemple) peuvent être directement montés dans ce même milieu sans rinçage préalable.

Bibliographie:

• Gagné, R.J. 1994. The gall midges of neotropical region. Cornell University, Ithaca and London: 352 pp.