Test ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)

Ces méthodes de laboratoire sont fréquemment utilisées dans le cadre de tests pour la certification des semences et plants, la réalisation de plans de surveillance ou la confirmation en cas de symptômes douteux. Toutefois, des kits de détection sont commercialisés afin de réaliser des détections directement au champ. 

Principe : 

• DAS-ELISA (Double-Sandwich)

Reconnaissance d’une protéine du bioagresseur ou produite par le bioagresseur (vert), appelée antigène, par une protéine produite en laboratoire appelée anticorps (rouge), qui est spécifique à l’agent recherché. Pour la révélation, une enzyme (E) liée à un second type d’anticorps (orange) et un substrat sont ajoutés. L’enzyme dégrade le substrat, qui se colore alors en jaune. Si le bioagresseur n’est pas présent, il n’y a pas de coloration.

• TAS-ELISA (Triple Sandwich)

Pour des seuils de détection élevés, de l’ordre du ng/mL, la méthode dite TAS-Elisa est utilisée. Le deuxième anticorps n’est pas lié à l’enzyme de révélation. Un troisième anticorps, spécifique au deuxième anticorps est ajouté. C’est sur ce dernier qu’est fixée l’enzyme de révélation.

Etapes au laboratoire :

Pour la méthode DAS-ELISA :

• Découpe des échantillons puis broyage en ajoutant du tampon de broyage.
• Ajout du premier anticorps, monoclonal, dit "coating" dans les puits de la plaque d'analyse. Cet anticorps est spécifique au bioagresseur recherché.
• Incubation pendant 2h à 37°C pour les anticorps "coating" se fixent au fond du puits.
• Lavage des puits pour éliminer les anticorps non fixés.
• Ajout du broyat d'échantillons dans les puits.
• Incubation pendant 12h.
• Lavage pour éliminer toutes les molécules non fixées.
• Ajout du deuxième anticorps, polyclonal, dit de "détection", lié à une enzyme. Cet anticorps n'est pas spécifique au bioagresseur recherché, il se fixe sur tous les types de bioagresseurs.
• Incubation pendant 2h.
• Lavage pour éliminer toutes les molécules non fixées.
• Ajout de l'agent révélateur, dit substrat.
• Incubation pendant 2h : si le bioagresseur est présent, le puits se colore en jaune.
• Selon le sérum utilisé, il est possible de faire une mesure d'intensité de la coloration pour avoir un résultat quantitatif.

Les informations présentées sont issues des fiches rédigées par des élèves ingénieurs de la spécialisation protection des cultures de l'ENSAIA dans le cadre des actions de l'axe 2 du RMT VEGDIAG.