Champignons

Pour obtenir la séquence d'un/plusieurs gène(s) code barre d'un champignon causant un symptôme, plusieurs étapes sont nécessaires. Il faut dans un premier temps isoler ce champignon et pourvoir le cultiver sur un milieu approprié (renvoyer à  un onglet ou ces methodologies sont décrites). Apres isolement du pahtogène, il est nécessaire d'extraire son ADN et d'amplifier par PCR la region d'ADN d'intéret pour l'identification. Le fragment PCR ainsi obtenu peut ensuite etre envoyé à un laboratoire pour séquençage.

• Méthodes 
  • Milieu de culture : Le milieu de culture le plus communement utilisé pour les champignons est le PDA (Potato Dextrose Agar, Difco). Les souches sont mises en culture sur boite PDA (90cm de diametre) à 20-22°C pendant 5 jours ou jusqu'à ce que le mycelium ait envahi la boite.
  • Isolement d'ADN genomic : Le mycélium ayant envahit la boite de culture est récolté et lyophylisé. La lyophilisation dure de 24h à 72h suivant le taux d’humidité et la quantité de matériel. Après la lyophilisation transférer le mycélium sec est broyé (par exemple avec: TissueLyser de Qiagen,1m30 à 28Htz, 2 billes tungstène par tube ) jusqu'à l'obtention une poudre. L'extraction d'ADN peut alors etre réalisée sur 100mg de matériel. (Mettre une technique phenol chloroforme qui marche pour tous cf Jonathan)
  • Amplification de gènes Barre Code : Selon le genre  auquel le champignon pathogène appartient, une ou plusieurs régions de l’ADN sont utilisés pour l’identification. Le gène code barre préférentiellement conseillé pour l’identification des champignons est l’ITS (schoch et al., 2012) mais d’autres gènes peuvent être utilisés comme le gène codant pour le facteur de transcription 1 Alpha( EF1 alpha), le gène codant pour la tubuline ou le gène codant pour l’actine. Les primers et protocoles d'amplification sont proposés sur le site R-syst fungi.
• Champignons pour lesquels un ou plusieurs code barres sont disponibles dans la base de données de séquence Lycovitis (R-syst) :